qPCR絕對(duì)定量與相對(duì)定量：原理、應(yīng)用與選擇策略

前言：




分子生物學(xué)研究中，實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）是強(qiáng)大工具，可精確測量特定DNA序列數(shù)量，其定量能力對(duì)基因表達(dá)分析等領(lǐng)域至關(guān)重要，能助我們理解基因表達(dá)量及確定病原體數(shù)量。

qPCR定量方法分absoiute定量和相對(duì)定量，本文將探討其定義、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、應(yīng)用場景及實(shí)際研究中的選擇應(yīng)用。




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qPCR的absoLute定量




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定義

absolute定量直接測量目標(biāo)分子拷貝數(shù)，不依賴參照基因表達(dá)水平，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中目標(biāo)分子absolute數(shù)量，適用于需知確切分子表達(dá)的情況。

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實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：準(zhǔn)備與目標(biāo)分子大小和GC含量相似的 核酸序列作標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行系列稀釋，對(duì)各稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行qPCR反應(yīng)并記錄Ct值，以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確保線性良好、R2值接近1。



實(shí)驗(yàn)操作步驟：從組織等提取DNA/RNA，配置含DNA/RNA模板等的反應(yīng)體系，在qPCR儀器上反應(yīng)并記錄目標(biāo)基因和標(biāo)準(zhǔn)品Ct值，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本中目標(biāo)分子absolute拷貝數(shù)。



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應(yīng)用場景

病毒載量測定：在病毒感染研究中，absolute定量可直接測量病毒基因拷貝數(shù)估算病毒載量。

基因拷貝數(shù)變異分析：在遺傳學(xué)研究中，absolute定量能精確測量特定基因拷貝數(shù)，助研究人員識(shí)別與疾病相關(guān)的基因拷貝數(shù)變異。




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qPCR的相對(duì)定量




（一）、定義

相對(duì)定量通過比較目標(biāo)基因與參照基因表達(dá)水平定量，無需知道目標(biāo)分子sbsolute拷貝數(shù)，用內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因表達(dá)量以消除實(shí)驗(yàn)變異，廣泛用于基因表達(dá)分析。 特別是在比較不同樣本或不同條件下基因表達(dá)變化的研究中。




（二）、相對(duì)定量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

內(nèi)參基因的選擇：選擇合適內(nèi)參基因是相對(duì)定量成功關(guān)鍵，其應(yīng)在所有樣本中穩(wěn)定表達(dá)，不受實(shí)驗(yàn)條件影響。選擇標(biāo)準(zhǔn)為穩(wěn)定性（表達(dá)在不同樣本和條件下保持穩(wěn)定）、相似的表達(dá)水平（與目標(biāo)基因相似以減少定量誤差）、無干擾（不應(yīng)與目標(biāo)基因存在交叉反應(yīng)）。常用內(nèi)參基因有管家基因，如β - actin、GAPDH等，在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)穩(wěn)定。



ΔΔCT方法：是常用相對(duì)定量分析方法，通過比較目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Ct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

計(jì)算過程為：先計(jì)算ΔCT（目標(biāo)基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值之差），再選一個(gè)樣本作對(duì)照組，計(jì)算其他樣本與對(duì)照組的ΔCT差值得ΔΔCT，最后用2^ - ΔΔCT公式計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。



（三）、相對(duì)定量的應(yīng)用場景

基因表達(dá)分析：相對(duì)定量可助研究人員了解特定基因在不同條件下的表達(dá)變化。操作步驟包括樣本收集、RNA提取、cDNA合成、qPCR反應(yīng)、數(shù)據(jù)分析（用ΔΔCT方法）。

條件變化下的表達(dá)差異分析：相對(duì)定量在比較不同條件下基因表達(dá)差異中很重要，如藥物處理、疾病狀態(tài)等。應(yīng)用示例有評(píng)估藥物分子作用機(jī)制（比較藥物處理前后基因表達(dá)變化）、尋找潛在生物標(biāo)志物（分析疾病與正常狀態(tài)下基因表達(dá)差異）。






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absolute定量與相對(duì)定量比較與選擇




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提優(yōu)缺點(diǎn)比較

sbsolute定量優(yōu)點(diǎn)：精確性高，能提供目標(biāo)分子精確拷貝數(shù)，適用于需具體數(shù)值的研究；直接測量，不依賴內(nèi)參基因，減少因內(nèi)參選擇不當(dāng)帶來的誤差

缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，需制備和分析標(biāo)準(zhǔn)曲線，增加實(shí)驗(yàn)復(fù)雜性和時(shí)間成本；成本較高，標(biāo)準(zhǔn)品制備需額外成本和時(shí)間。

相對(duì)定量優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，不需要制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。 優(yōu)點(diǎn)：簡單，可通過選合適內(nèi)參基因適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)條件。

缺點(diǎn)：依賴內(nèi)參基因，結(jié)果準(zhǔn)確性取決于其穩(wěn)定性，表達(dá)不穩(wěn)定會(huì)影響結(jié)果；相對(duì)測量可能因內(nèi)參選擇不當(dāng)引入誤差。

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選擇依據(jù)

實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/strong>需知目標(biāo)基因確切拷貝數(shù)（如病毒載量測定、基因拷貝數(shù)變異分析）選absolute定量；比較不同樣本或條件下基因表達(dá)變化（如基因表達(dá)分析、條件變化下表達(dá)差異分析）選相對(duì)定量。

樣本類型和數(shù)量：稀有或珍貴樣本，absolute定量更合適，能提供更精確測量；處理大量樣本，相對(duì)定量更高效，可簡化實(shí)驗(yàn)流程。

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    Best實(shí)踐建議

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建議：制備標(biāo)準(zhǔn)曲線用與樣本來源相似標(biāo)準(zhǔn)品提高定量準(zhǔn)確性；選在實(shí)驗(yàn)條件下表達(dá)穩(wěn)定、無顯著變化的內(nèi)參基因；至少進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)確保結(jié)果可靠、可重復(fù)。

數(shù)據(jù)分析建議：相對(duì)定量中對(duì)數(shù)據(jù)適當(dāng)歸一化處理減少技術(shù)變異影響；解釋結(jié)果時(shí)考慮實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本處理和數(shù)據(jù)分析各步可能引入的變異；用專業(yè)數(shù)據(jù)分析軟件提高分析準(zhǔn)確性和效率。